Dienstleistung - Oligonukleotide - Technische Informationen

Technische Informationen

GeneCust liefert Oligonukleotide höchster Qualität, die alle Forschungsanforderungen erfüllen. Unsere Oligonukleotidsynthese-Dienstleistung bietet die individuelle Synthese hochqualitativer Oligonukleotide in verschiedenen Größen und Formaten, einschließlich einer Vielfalt von modifizierten Oligos und Reinigungsgraden.

Wie funktioniert das?

Oligonukleotide werden mit Hilfe von Phosphoramiditen chemisch synthetisiert. Ein Phosphoramidit ist ein normales Nukleotid, zu dessen reaktiven Amin-, Hydroxyl- und Phosphatgruppen Schutzgruppen hinzugefügt werden.

dA(bz) Phosphoramidite dC(bz) Phosphoramidite
dA(bz) Phosphoramidit dC(bz) Phosphoramidit
dG(bz) Phosphoramidite dT(bz) Phosphoramidite
dG(bz) Phosphoramidit dT(bz) Phosphoramidit

Diese Schutzgruppen verhindern unerwünschte Nebenreaktionen und erzwingen die Bildung des gewünschten Produkts während der Synthese. Die 5'-Hydroxylgruppe wird durch DMT (Dimethoxytrityl) geschützt, die Phosphatgruppe durch eine Diisopropylamino (iPr2N)-Gruppe und eine 2-Cyanoethyl (OCH2CH2CN)-Gruppe. Auch die Basen haben Schutzgruppen an der exozyklischen Amingruppe (Benzoyl oder Isobutyryl). Am Ende des Syntheseprozesses werden alle Schutzgruppen beseitigt.

Bei der Festphasensynthese wird das 3'-Ende des Oligonukleotids an eine feste Haltesäule gebunden, an der alle Reaktionen stattfinden. Die 3'-Gruppe der ersten Base wird über einen Binder mit einer festen Halterung (Styroporkügelchen oder ähnlich) verbunden. Dies ermöglicht das bequeme Zugeben oder Entfernen von Reagenzien. In jedem Schritt werden die Lösungen mit den Nukleotiden für die nächste Reaktion von einem speziellen Reagenzien-Abgabesystem durch die Säule gepumpt und ausgewaschen, bevor das nächste Nukleotid hinzu gegeben wird. Am Ende des Syntheseprogramms wird das Oligonukleotid von der festen Halterung abgespalten und aus der Säule eluiert.

Der Synthesezyklus

Die Oligonukleotid-Synthese erfolgt mit einem Zyklus, der vier chemische Reaktionen umfasst, die solange wiederholt werden, bis alle gewünschten Basen hinzugegeben worden sind:

Oligo Synthesis Process

Schritt 1 Entblockung (Detritylation): Das DMT wird mit einer Säure wie TCA (Tri-Chlor-Essigsäure) entfernt und ausgewaschen; an der ersten Base entsteht eine freie 5'-Hydroxylgruppe.

Schritt 2 Kondensation der Base (Koppelung): Ein Phosphoramidit-Nukleotid (oder ein Mix) wird mit Tetrazol aktiviert, das die iPr2N-Gruppe an der Phosphatgruppe beseitigt. Nach der Zugabe reagieren die ungeschützte 5'-OH-Gruppe der ersten Base und das Phosphat der zweiten Base, so dass die beiden Basen mittels einer Phosphit-Verbindung verbunden werden. Diese Reaktionen erfolgen nicht in Wasser, sondern in Tetrahydrofuran oder DMSO (Dimethylsulfoxid). Ungebundene Basen und Nebenprodukte werden ausgewaschen.

Schritt 3 Sperrung: Ca. 1% der 5'-OH-Gruppen reagieren nicht mit der neuen Base und müssen für weitere Reaktionen gesperrt werden, damit es nicht zu einer Oligonukleotid-Synthese mit interner Basen-Deletion kommt. Dies erfolgt durch Zugabe einer Schutzgruppe in Form von Essigsäureanhydrid und 1-Methylimidazol, das mittels Acetylierung mit den freien 5'-OH-Gruppen reagiert. Überschüssige Reagenzien werden ausgewaschen.

Schritt 4 Oxidation: Die Phosphit-Verbindung zwischen der ersten und der zweiten Base muss stabilisiert werden, indem die Phosphatgruppe pentavalent gemacht wird. Dies wird durch die Zugabe von Jod und Wasser erreicht, welche die Oxidation des Phosphits zu Phosphat bewirkt. Dieser Schritt kann durch eine Sulphorylierung für Thiophosphat-Nukleotide ersetzt werden.

Nach der eigentlichen Synthese sind 2 weitere Arbeitsschritte erforderlich. Zuerst muss die Oligogruppe von der festen Halterung abgespalten werden, indem das an die Halterung gebundene Oligonukleotid mit einer konzentrierten Ammoniaklösung behandelt wird. Dann müssen die Schutzgruppen von den Adenin-, Guanin- und Cytidin-Basen entfernt und die exozyklische Amin-Funktion ausgelöst werden; dann wird die Ammoniak-Oligonukleotid-Lösung bei höheren Temperaturen inkubiert (in der Regel zwischen 50°C und 80°C während 1 bis 8 Stunden je nach dem verwendeten Protokoll und den verwendeten Schutzgruppen) inkubiert.

Reinigung

Die Wahl der Reinigungsmethode richtet sich nach dem Oligonukleotidtyp und nach den von Ihnen gewünschten Reinheitsgraden bzw. Erträgen. Es besteht eine Wechselbeziehung zwischen Reinheit und Ertrag: Je höher die Reinheit ist, desto geringer ist der Ertrag und je geringer die Reinheit ist, desto höher ist der Ertrag.

Reinigung mittels Reverse-Phase-Kartusche

Die Reinigung mittels Reverse-Phase-Kartusche bietet den niedrigsten Reinheitsgrad (in der Regel 80%). Die Trennung beruht auf der Hydrophobizitätsdifferenz zwischen dem Volllängenprodukt mit DMT-Schutzgruppen und den abgeschnittenen Sequenzen (ohne DMT-Gruppen).

Da die Hydrophobizitätsunterschiede zwischen dem Volllängen-DMT-Produkt und den abgeschnittenen Nicht-DMT-Sequenzen mit erhöhter Oligo-Länge abnehmen, empfiehlt sich die Kartuschen-Reinigung nicht für Oligos > 50 Basen.

HPLC Reverse-Phase-Reinigung

Die Reverse-Phase-HPLC funktioniert nach demselben Prinzip wie die Reverse-Phase-Kartuschen, erzielt aber im Regelfall eine Produktreinheit von 90%. Das Auflösungsvermögen und die Auflösungseigenschaften von HPLC-Säulen sind viel besser als bei den Kartuschen; deshalb ist HPLC die bevorzugte Methode zum Reinigen größerer Oligo-Mengen (> 1 µmol). Genau wie bei den Kartuschen wird Reverse-Phase-HPLC in der Regel nicht zum Reinigen von Oligos mit einer Länge von über 50 Basen empfohlen.

Polyacrylamid-Gel-Reinigung (PAGE)

Die Reinigung mit dieser Methode gilt als ‚Gold Standard’ für die Oligonukleotid-Reinigung; mit ihr wird eine Reinheit von 95-99% erzielt. Die Gel-Reinigung kann für alle Oligonukleotid-Längen verwendet werden und wird für alle Anwendungen mit Klonierung des Produkts wie Mutagenese und Genkonstruktion wärmstens empfohlen. Die Erträge bei der PAGE-Methode sind aufgrund der wenig effizienten Extraktion von Oligos durch das Gel geringer als bei anderen Methoden.

Berechnungen: Abschätzung der erforderlichen Scale

Oligonukleotide werden nach Scale und nicht nach Menge bestellt. Denn jedes Oligonukleotid ist ein ganz individuelles Molekül mit speziellen synthetischen Eigenschaften, die auf Sequenz und Modifikationen beruhen. Deshalb können die Erträge der Synthese der einzelnen Oligonukleotide unterschiedlich sein und sie können in verschiedenen Maßeinheiten wie Milligramm oder Gramm, Mol oder OD angegeben werden. Sie entscheiden, welche Scale Sie benötigen, um ausreichende Mengen zu bekommen.

Wie wird der Ertrag gemessen?

Der Ertrag aller Oligonukleotide wird mit Hilfe der Absorbanz gemessen. Die UV-Spektroskopie ist eine sehr präzise Methode zur Messung des Ertrags der Oligonukleotide, da bei ihr Salz, Wasser und andere Synthesereste, die das Gewicht beeinflussen, unberücksichtigt bleiben. Das Oligonukleotid wird in Wasser oder Pufferlösung gelöst und es wird die Absorbanz bei 260 nm bestimmt.

Umrechnungen

Die Umrechnung der OD260-Einheiten in mmol kann mit dem Beerschen Gesetz erfolgen, das mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten ε, einer für jede Substanz spezifische Konstante, eine Beziehung zwischen Absorbanz und Konzentration herstellt:

Beersches Gesetz: Absorbanz=[Konzentration].ε kann abgeleitet werden zu: [Konzentration] = Absorbanz/ε

Die Einheiten von Extinktionskoeffizienten sind (OD260-Einheiten)(mL) (µmol)-1, die Einheiten der Konzentration sind (µmol)(mL)-1 und die Absorbanz wird in OD260-Einheiten ausgedrückt. Der Extinktionskoeffizient wird für jedes einzelne Oligonukleotid berechnet. Es gibt unterschiedliche Formulierungen für diese Berechnung. Die genauste Methode ist die experimentelle Bestimmung vom Extinktionskoeffizienten, doch dies ist ein sehr langer, schwieriger Prozess. Deshalb besteht eine weitere Lösung in der Verwendung des so genannten Nearest Neighbour-Modells. Dieses Modell entspricht in guter Näherung der Summe der Extinktionskoeffizienten (?) der einzelnen Nukleotide in der Sequenz. Mit Hilfe der Sequenzdaten des Oligos und des OD-Werts lassen sich Konzentration und Menge des Materials wie folgt berechnen:

Distribio

A,G,C,T: Anzahl von Basen im Oligonukleotid

Distribio

Zur Bestimmung der Masse des Oligonukleotids müssen Sie die Mol-Anzahl mit dem Molekulargewicht multiplizieren:

Distribio

Das Molekulargewicht eines Oligonukleotids wird anhand der Anzahl einzelner Nukleotide im Oligonukleotid und anhand der möglichen Modifikationen des Oligonukleotids berechnet:

MWoligo = 313,2*A + 329,2*G + 289,2*C + 304,2*T + MWmod - 61*(g/mol)

A,G,C,T: Anzahl von Basen im Oligo

MWmod: Molekulargewicht einer eventuellen Modifikation

Welche Faktoren beeinflussen den Ertrag Ihres Oligonukleotids?

Die Produktmenge, die theoretisch mit einer speziellen Synthese realisierbar ist, wird durch die Qualität der Synthese selbst, die in einem automatisierten Synthesizer durchgeführt wird, bestimmt. Dabei ist die Koppelungseffizienz der Synthese sehr wichtig. Dies lässt sich leicht nachweisen, indem der theoretische Ertrag mit folgender Formel berechnet wird:

Distribio

Wobei X die mittlere Koppelungseffizienz und y die Anzahl von Koppelungen ist. So bringt z.B. eine Synthese von 30 mer (die 29 Koppelungen erfordert) mit einer durchschnittlichen Koppelungseffizienz von 99% theoretisch 75% Produkt (0,9929). Dieselbe Synthese mit einer Effizienz von 98% hat einen maximalen Ertrag von nur 55%. In der nachstehenden Grafik ist der Syntheseertrag mit einer durchschnittlichen Koppelungseffizienz von 98,5% dargestellt.

Distribio

Viele Faktoren haben einen Einfluss auf die Koppelungseffizienz, wie z.B. der Feuchtigkeitsgehalt im Acetonitril und die Qualität des Phosphoramidits. Auch das Wetter spielt eine Rolle. An Tagen mit hoher Luftfeuchtigkeit leidet die Qualität der Synthese, da eine nahezu vollständige Beseitigung des Wassers so gut wie unmöglich ist, auch wenn praktisch wasserfreie chemische Verfahren verwendet werden. Die Nebenreaktion kann ebenfalls zu einer Ertragsverringerung führen.

Je nach der Qualität der Synthese kann die Reinigung der Schritt mit der größten Ertragseinbuße sein. Bei einer hochqualitativen Synthese wird nur eine bescheidene Menge an Unreinheiten zu entfernen sein, der Reinigungsaufwand ist damit geringer. Mittlere und schlechte Synthesen enthalten mehr Verunreinigungen, die in die Produktspitze gelangen, und erfordern damit einen größeren Reinigungsaufwand, um eine akzeptable Reinheit zu bekommen. Ungeachtet der Qualität der Synthese ist der Gesamtreinigungsprozess relativ kostspielig.

Dennoch kann GeneCust trotz all dieser Schwierigkeiten einen Mindestertrag für nichtzertifizierte Standard-Oligos mit max. 30 Basen garantieren:

  • * 10 nmol Scale: 4,5 nmoles
  • * 40 nmol Scale: 20 nmoles
  • * 200 nmol Scale: 95 nmoles
  • * 1000 nmol Scale: 400 nmoles

Qualitätskontrolle

Ein striktes Qualitätskontrollsystem gewährleistet, dass Sie bei uns Oligonukleotide höchster Qualität bekommen. Vor der Synthese wird geprüft, dass sämtliche Chemikalien unserem Qualitätsstandard entsprechen. Während der vollautomatischen Oligosynthese werden alle Schritte der Synthese durch mehrfache Kontrollfunktionen in den DNA-Synthesizern überwacht. Auf diese Weise können wir sicherstellen, dass die Koppelungseffizienz der Synthese unsere Anforderungen erfüllt.

Anschließend werden die Oligonukleotide entschützt, entsalzt und es wird ihre optische Dichte bei 260 nm gemessen. Zudem werden die Oligos randommäßig mittels Gel-Elektrophorese analysiert und jedes Oligonukleotid wird durch Messung der Molekularmasse kontrolliert. Alle Oligos mit schlechtem bzw. ungenügendem MS-Profil werden auf Kosten von GeneCust einer erneuten Synthese unterzogen.